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如何作QPCR的标准曲线

作QPCR的标准曲线可以用PCR－ELISA法作。具体如下：PCR－ELISA法：利用地高辛或生物素等标记引物，扩增产物被固相板上特异的探针所结合；再加入抗地高辛或生物素酶标抗体－辣根过氧化物酶结合物，最终酶使底物显色。常规的PCR－ELISA法只是定性实验，加入内标，作出标准曲线，也可实现定量检测目的。通过测定一系列已知组分的标准物质的某理化性质，从而得到该性质的数值所组成的曲线。

以标准品浓度的对数值（通常是log10）为X轴，Ct值为Y轴，绘制标准曲线。分析标准曲线：一条合格的标准曲线的相关系数（R2）应大于0.99，越接近于1，结果的可信度越高。扩增效率（E）应在0.9-1之间，越接近于1越理想。如果标准曲线不符合预期，可能需要优化引物、探针或qPCR条件。

构建标准曲线在qPCR绝对定量中扮演关键角色。步骤如下：首先准备标准样品，通过从已知浓度的DNA或RNA模板制备一系列不同浓度的稀释样本。接着设计引物和探针，确保其特异性结合目标序列，并在PCR反应中产生可信赖信号。进行qPCR反应，使用准备的样本记录荧光信号变化。

构建标准曲线的一般步骤包括选择合适的标准品、精确定量标准品、制作标准品稀释液、进行qPCR扩增、收集荧光数据和绘制标准曲线。合格的标准曲线应具备高相关系数和理想的扩增效率。在执行QPCR实验时，应注重标准品的选择、定量、稀释以及实验过程中的污染控制、重复性以及遵循标准操作流程。

qPCR引物扩增效率可以通过制作标准曲线来评估。标准曲线的制作方法：选择标准品：为了保证标准品和待测样品有一致的扩增效率，标准品与待测样品应有较高的同源性。这是制作标准曲线的基础，也是确保评估结果准确性的关键。

qPCR标准曲线绝对定量样品准备 从准备好的已知病毒样本中提取RNA，测定浓度后，按需进行梯度稀释，得到不同浓度的稀释样品。可使用体外转录RNA作为标准品。引物、探针设计 设计一段靶向病毒序列中长度在100bp的RNA（目标序列）的引物/探针，用于制作标准曲线。