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在测定Pod活性的时候,要求反应时间内吸光度的变化,为什么

在测定过氧化物酶活性时，要求反应时间内吸光度的变化，主要原因如下：酶促反应持续进行：在酶的催化下，H2O2与愈创木酚反应生成茶褐色产物，这一反应是持续进行的。随着反应的进行，产物的生成量不断增加，导致溶液的吸光度也随之变化。

测定过氧化物酶活性使用愈创木酚法，原理是在酶的催化下，H2O2aq与愈创木酚反应生成茶褐色产物。此产物在470nm波长下具有最大吸收值，通过紫外分光光度计测定吸光度，反推酶活性。实验每分钟读一次吸光度，因为酶促反应持续进行，产物生成导致吸光度变化。

过氧化物酶催化H2O2氧化酚类物质，产生有色化合物。在愈创木酚法中，POD催化H2O2将愈创木酚氧化为红棕色的4-邻甲氧基苯酚，其470 nm处有高光吸收，因此可利用比色法测量其活性。实验所需材料包括各种果蔬，以及研磨设备、离心机、分光光度计等仪器，以及醋酸缓冲液、愈创木酚、H2O2等试剂。

pod酶活性测定方法有定时法、连续监测法、平衡法。定时法 通过测定酶反应开始后某一时间段内（t1到t2）产物或底物浓度的总变化量来求取酶反应初速度的方法。其中t1往往取反应开始的时间。该法最基本的一点是停止反应后才测定底物或物的变化。优点：简单易行，对试剂要求不高。

在过氧化物酶（POD）催化下，H2O2将愈创木酚氧化成茶褐色产物。此产物在470 nm处有最大光吸收值，故可通过测470 nm下的吸光度变化测定过氧化物酶的活性。 设备与试剂 分光光度计，TDL-5000B型低速冷冻多管离心机（R=18cm），研钵，容量瓶，量筒，试管，吸管。

在什么情况下才测抗氧化酶活力

在动物实验中，通常会通过测定服用抗氧化剂一段时间后血液中丙二醛（MDA）的变化、以及肝脏匀浆中超氧化物歧化酶（SOD）和谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-PX）的活力变化来评估抗氧化效果。根据这两种酶和MDA的变化情况，可以判断抗氧化的强度和效果。

氧化应激生物标志物：这是一类重要的抗氧化指标，如血浆中的超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化氢酶（CAT）等。这些酶类物质的活性水平可以反映机体对抗氧化应激的能力。当机体受到氧化应激时，这些酶的活性会增加以对抗自由基的损害。

蛋白质氧化产物如8-表氢氧异前列腺素的测定，通过与DNPH反应生成沉淀，测定吸光度来计算。此外，SOD活力通过分光光度法测量，GSH-Px活力则根据GSH减少量来计算。抗氧化物质测定涉及GSH与DTNB的反应，通过特定的样品制备、测定和计算步骤得出结果。

超氧物歧化酶（SOD）广泛存在于动植物体内，是一种重要的抗氧化酶，用于清除超氧阴离子自由基。氮蓝四唑（NBT）法是测定SOD活性的一种常用方法。其原理是SOD能抑制NBT在光下的还原作用，进而减少蓝色甲腙的生成。NBT在560nm处有最大吸收，通过测量这一波长下的吸光度，可以计算出SOD的活性。

果蔬中过氧化物酶活性的测定

1、实验所需材料包括各种果蔬，以及研磨设备、离心机、分光光度计等仪器，以及醋酸缓冲液、愈创木酚、H2O2等试剂。具体制备过程中，需先制备酶液，通过研磨果蔬并离心提取酶提取液，然后进行活性测定，通过在特定波长下测定吸光度变化，计算出每分钟吸光度变化值，以此确定过氧化物酶的活性。

2、果蔬中过氧化物酶活性的测定主要通过愈创木酚法进行。具体方法和注意事项如下：测定方法： 原理：过氧化物酶催化H2O2氧化酚类物质，产生有色化合物。在愈创木酚法中，POD催化H2O2将愈创木酚氧化为红棕色的4邻甲氧基苯酚，该物质在470 nm处有高光吸收，因此可利用比色法测量其活性。

3、在测定过氧化氢酶活力时，我们通常会测量反应溶液在特定波长下的吸光度值。随着过氧化氢酶的活性增加，反应溶液的吸光度会随时间而降低。根据吸光度的变化，可以计算出过氧化氢酶的活性单位，通常以每克鲜重（FW）果蔬样品每分钟吸光度变化值增加1时为1个过氧化物酶活性单位（U）。

4、检验酶的活性。烫漂时间一般以过氧化氢酶和过氧化物酶恰好失活为标准来确定烫漂的时间。

5、过氧化物酶属于最耐热的酶类，在果蔬加工中常被当作热处理是否充分的指标。

植物组织中有哪些物质影响丙二醛的测定

植物组织中的丙二醛（MDA）在酸性条件下与硫代巴比妥酸（TBA）反应会产生粉红色产物3，5，5-三甲基恶唑-2，4-二酮（Trimethine），并在539nm波长下展现吸收峰。为了校正硫代巴比妥酸与其他物质反应带来的影响，测定600nm下的吸光度，并利用两者的差值来计算MDA含量。

逆境条件的影响：丙二醛含量高，意味着植物细胞膜质过氧化程度高，细胞膜受到的伤害严重。一般而言，在高温、盐碱、强光等逆境条件下，植物细胞膜会受到伤害。 可溶性糖的干扰：植物遭受干旱、高温、低温等逆境胁迫时，可溶性糖会增加。

一：原理丙二醛（MDA）是常用的膜脂过氧化指标，在酸性和高温度条件下，可以与硫代巴比妥酸（TBA）反应生成红棕色的三甲川（3，5，5-三甲基恶唑-2，4-二酮），其最大吸收波长在532nm。

丙二醛含量是植物细胞膜质过氧化程度的体现，丙二醛含量高，说明植物细胞膜质过氧化程度高，细胞膜受到的伤害严重。一般植物在逆境条件下，如高温，盐碱，以及强光等逆境条件下就会产生膜质过氧化。

植物组织pod活性的测定注意事项

1、待测样品中不能含有酶抑制剂，同时需避免反复冻融。 POD酶液提取时，注意低温操作，防止酶活性。 以煮沸的酶液为对照时，酶要充分失活。 POD氧化剂具有一定腐蚀性，请小心操作。 POD氧化剂易挥发，请密闭保存，否则检测效率下降。 如果没有分光光度计，也可以使用普通的酶标仪测定，每次检测指标不宜过多，否则操作时间不一，有可能导致样本间的差异。

2、植物体内过氧化物酶（POD）活性的测定通常采用光度法或荧光法。光度法：将植物组织或提取物加入含有过氧化氢和双甲基苯酚的反应液中，过氧化物酶催化过氧化氢分解产生的游离基与双甲基苯酚发生氧化反应，生成苯醌衍生物，产生黄色或棕色的化合物。可以通过测定反应液的吸光度或比色板的读数来测定POD活性。

3、植物POD活性的正常范围是440.327~52463U/g。这个范围是通过对大量植物样品的测量得出的平均值和标准差。POD活性的单位是U/g，表示每克植物组织中的过氧化物酶活性。POD活性的测量通过酶学方法进行，常用的是测定POD催化反应产生的染色产物的吸光度变化。这种测量方法可以反映出植物体内POD的活性水平。

4、参与生命过程：过氧化物酶参与了呼吸作用、光合作用及生长素的氧化等多个重要生命过程。组织老化指标：在植物生长发育的不同阶段，过氧化物酶的活性会呈现出动态变化。老化组织中过氧化物酶的活性相对较高，因此可以作为评估组织老化的生理指标。

5、活性测定POD活性测定采用愈创木酚法（Lurie等，1997）。用酶标仪进行测定时按比例调整为总反应体积为400μL。反应体系为30μL粗酶液，290 L 0.3%愈创木酚（用50 mmol/L的PBS配制，pH 4）和 80L0.3%H2O2（用50 mmol/L的PBS配制，pH 4）。

提取pod时,为什么要在冰浴中研磨植物样品

1、提取pod时，要在冰浴中研磨植物样品原因如下：为了保持样品的稳定性和防止样品中的化学成分被破坏。研磨可以增加样品表面积，使得提取液能够更好地与样品接触，从而提高提取效率。冰浴可以降低样品温度，减缓化学反应速率，从而减少样品中化学成分的分解和变化。所以提取pod时，要在冰浴中研磨植物样品。

2、提取pod时，因为样品的稳定性要在冰浴中研磨植物样品。冰浴可降低样品的温度，从而会减少样品中化学成分分解和变化，因此，提取pod时，因为样品的稳定性要在冰浴中研磨植物样品。

3、缺点：难保证测定结果的真实性。难以确定反应时间段酶促反应是否处于线性期。随着保温时间的延续，酶变性失活加速。连续监测法 又称为动力学法或速率法、连续反应法。在酶反应过程中，用仪器监测某一反应产物或底物浓度随时间的变化所发生的改变，通过计算求出酶反应初速度。

4、实验应严格控制时间，确保计时精确，动作迅速，以保证实验结果准确性。提取酶液时，离心量应准确，反应系统酶液量要精确。提取粗酶液应在低温条件下进行，采用冰浴研磨，离心时低温下进行，尽量避免温度对酶活性的影响。

5、④750umol/l NBT：称取0.06133gNBT，用磷酸缓冲溶液溶解并定容至100ml，避光保存。⑤200umol/l核黄素溶液：遮光保存，随用随配。参照王晶英等[82]的NBT还原法测定。取芽（剥除鳞片）0.25 g于预冷的研钵中，加2 mL预冷的提取介质。